體細(xì)胞核移植（somaticcellnucleartransfer,SCNT）技術(shù)，也叫克隆技術(shù)，是指將體細(xì)胞的核移入去核卵母細(xì)胞中，使其發(fā)生重編程并發(fā)育為新的胚胎個(gè)體的技術(shù)，這是唯一一種能將終端分化的體細(xì)胞轉(zhuǎn)變成為具有全能性胚胎的技術(shù)。近年來(lái)，伴隨CRISPR/Cas9基因精確編輯體系的發(fā)展，克隆技術(shù)在豬分子育種上的應(yīng)用潛力逐漸顯現(xiàn)，一批與優(yōu)勢(shì)經(jīng)濟(jì)性狀和抗病性狀相關(guān)的克隆豬模型被紛紛創(chuàng)制。此外，由于豬和人類生理結(jié)構(gòu)的相似性，克隆豬模型還可應(yīng)用于人類器官再造和疾病病理研究，這都反映出豬克隆技術(shù)在農(nóng)業(yè)育種和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域存在巨大的應(yīng)用前景。非瘟疫情影響下，克隆技術(shù)還能應(yīng)用于地方種、引進(jìn)種和新培育豬品種的種質(zhì)資源保存。
不過(guò)自克隆羊“多莉”誕生以來(lái)，哺乳動(dòng)物克隆胚胎早期發(fā)育的高損率（克隆囊胚率僅15%，受精囊胚率可達(dá)80%）和極低的出生效率（克隆動(dòng)物約2%，受精動(dòng)物可達(dá)60%）一直是限制克隆技術(shù)推廣應(yīng)用的瓶頸問(wèn)題。目前的主流觀點(diǎn)認(rèn)為，受體卵母細(xì)胞對(duì)供體細(xì)胞基因組存在天然的重編程障礙,導(dǎo)致克隆胚胎出現(xiàn)表觀遺傳修飾的異常富集和相應(yīng)基因的異常表達(dá)，而尋找克服重編程障礙的有效方法一直是突破豬克隆技術(shù)應(yīng)用壁壘的研究熱點(diǎn)。
華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)科動(dòng)醫(yī)學(xué)院苗義良團(tuán)隊(duì)與生科院陳振夏團(tuán)隊(duì)合作在StemCellReports雜志上發(fā)表了題為TDGisapig-specificepigeneticregulatorwithinsensitivitytoH3K9andH3K27demethylationinnucleartransferembryos的研究論文，報(bào)道了豬克隆胚胎發(fā)育過(guò)程中組蛋白甲基化H3K9meH3K27me3以及DNA甲基化的重編程障礙，以及克服上述重編程障礙并促進(jìn)豬克隆胚胎發(fā)育的兩種新方法。
該研究首先利用低細(xì)胞量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（Smart-seq）技術(shù)，繪制了豬體內(nèi)受精胚胎、克隆胚胎和供體成纖維細(xì)胞（pigfetalfibroblast,PFF）的轉(zhuǎn)錄圖譜。通過(guò)比對(duì)分析，從全基因組層面鑒定了豬克隆胚胎在胚胎基因組激活（embryonicgenomeactivation,EGA）階段（4細(xì)胞期）異常表達(dá)的基因和基因組區(qū)域，包括胚胎基因組激活失?。‥GA-OFF）的基因1230個(gè)和基因組區(qū)域745個(gè)，以及供體細(xì)胞記憶擦除失?。≒FF-ON）的基因529個(gè)和基因組區(qū)域589個(gè)。
接下來(lái)，該研究利用低細(xì)胞量染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序（ULI-NChIP-seq）技術(shù)，繪制了克隆胚胎和供體成纖維細(xì)胞組蛋白甲基化H3K4meH3K9meH3K27me3的富集圖譜，由此確定了上述異常表達(dá)的基因啟動(dòng)子和基因組區(qū)域中存在高水平富集的組蛋白甲基化H3K9me3和H3K27me3。最重要的是，針對(duì)這些重編程障礙，該研究聯(lián)合使用顯微注射技術(shù)在克隆胚胎中過(guò)表達(dá)H3K9me3的去甲基化酶KDM4A，并向胚胎培養(yǎng)液中添加H3K27me3編寫酶抑制劑GSK126，最終清除了4細(xì)胞胚胎H3K9me3和H3K27me3的異常富集，調(diào)整了豬克隆胚胎異常表達(dá)的基因和基因組區(qū)域，并最終使克隆胚胎的囊胚率提高近兩倍。
研究人員意外發(fā)現(xiàn)了一個(gè)豬胚胎基因組激活階段特異表達(dá)的因子——胸腺嘧啶糖基化酶TDG，該因子參與DNA主動(dòng)去甲基化。有趣的是，上述清除異常組蛋白甲基化的方法并未激活TDG的表達(dá)。該研究隨后利用低細(xì)胞量全基因組DNA甲基化測(cè)序（PBAT-seq）技術(shù)，確定了異常表達(dá)的基因啟動(dòng)子和基因組區(qū)域中存在高水平富集的DNA甲基化。而使用誘導(dǎo)表達(dá)TDG的供體細(xì)胞株構(gòu)建克隆胚胎可以顯著降低4細(xì)胞胚胎的DNA甲基化水平，并提高了其囊胚發(fā)育能力。
豬克隆胚胎在胚胎基因組激活階段的重編程障礙和克服途徑
總之，該研究旨在降低豬克隆胚胎早期發(fā)育的高損率，從而推動(dòng)克隆技術(shù)更快更高效地運(yùn)用于克隆豬模型的規(guī)?；a(chǎn)。這不僅拓展了哺乳動(dòng)物胚胎早期發(fā)育階段重編程障礙的發(fā)生機(jī)制，也為克隆技術(shù)在促進(jìn)其他家畜動(dòng)物、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物和寵物等方面提供了新的參考方案。
華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)科動(dòng)醫(yī)學(xué)院苗義良教授和生科院陳振夏教授為本文共同通訊作者。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)科動(dòng)醫(yī)學(xué)院副研究員劉鑫和王濤博士、生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院陳露博士后為本文的共同第一作者。
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